▷ CORONAVIRUS: PRUEBA MOLECULAR Vs. PRUEBA SEROLÓGICA | CUAL ES LA MEJOR?

El número de pruebas de diagnóstico para SARS-CoV-2 está explotando. Una de estas pruebas detecta ARN viral y la otra detecta anticuerpos contra partículas del virus. Pero, ¿cuál es el mejor? Para ayudar a comunicar cómo funcionan los diferentes tipos de pruebas, qué miden y cuándo se usan mejor, hemos preparado una infografía.

El perfil de biomolécula activa y posterior a la infección define la prueba adecuada.

El primer paso para comprender qué prueba es la mejor, es comprender el ciclo de vida de la infección viral. Técnicamente el virus no está vivos. Infectan las células y convierten la maquinaria molecular de su huésped en fábricas de producción de virus. Las células infectadas producen un gran número de partículas virales (viriones) que infectaran a otra célula, repitiendo este proceso y aumentando rápidamente los números en un período de tiempo relativamente corto.

En unos pocos días, el número de viriones infecciosos aumenta sustancialmente. Más tarde, la infección disminuye y la cantidad de viriones disminuye. Esta disminución está relacionada con el sistema inmunitario de los anfitriones que lucha contra el virus o debido a que el virus está “inactivo” dentro del huésped. Si ninguno de los dos sucede, el huésped puede morir.

Lo que significa el ciclo de vida viral desde una perspectiva de prueba diagnóstica es que ciertos tipos de biomoléculas como los ácidos nucleicos virales (ARN o ADN) o los anticuerpos del huésped son abundantes en diferentes momentos entonces significan que podemos detectarlos.

Como las pruebas moleculares detectan ácidos nucleicos y las pruebas serológicas detectan anticuerpos, son las biomoléculas más adecuadas en estos momentos porque están disponibles.

¿Recuerda el primer SARS (Síndrome Respiratorio Agudo Severo, en 2002-2004)? Fue un episodio anterior de lo que ahora estamos experimentando, pero con una infección mucho más grave por un coronavirus menos infeccioso. Por lo tanto, no requería las contramedidas extremas que ahora se necesitan para frenar la pandemia actual.

Sin embargo, un aporte de esa primera experiencia de SARS fue que produjo datos que podemos usar para hacer modelos predictivos de las infecciones actuales de SARS-CoV-2. Como se observa en el gráfico, las primeras biomoléculas son ARN virales (vRNA – los virus corona son virus ARN). A medida que el virus se replica, aumenta el número de viriones (cada uno con una molécula de ARNv) y su ARN se vuelve más detectable. Más tarde, a medida que disminuye la concentración de vRNA, y aumenta el número de moléculas de anticuerpos.

Los primeros anticuerpos son los anticuerpos pentaméricos IgM. Más tarde, las células que producen IgM cambian a IgG. Así, el ARNv es un biomarcador para detectar infecciones activas y las IgM/IgG son biomarcadores para el monitoreo activo, tardío y posterior a la infección.

Las infecciones activas pueden durar de 21 a 28 días; quizás más tiempo en algunas personas. Esta es la razón por la cual las personas que se enferman deben permanecer en cuarentena durante al menos 14 días, ya que puede tomar hasta dos semanas para mostrar síntomas y luego otras dos semanas para recuperarse. Después de 7-14 días, se producen anticuerpos del huésped y están presentes mucho más tiempo. La IgM se cae después de unas pocas semanas o meses y la IgG puede persistir durante meses o años.

Pero, aunque tenemos algunos datos para el coronavirus del SARS 2002-2004, se desconoce la persistencia de anticuerpos específicos para las proteínas del SARS-CoV-2 (signos de interrogación en el gráfico). La única forma de saber cuánto tiempo persisten los anticuerpos es monitorear a los pacientes con COVID-19 durante mucho tiempo. Parte de esta ciencia está en marcha.

Los exámenes

El perfil de la biomolécula nos dice que las pruebas moleculares solo pueden usarse para detectar infecciones activas y las pruebas serológicas son las mejores para el monitoreo posterior a la infección. Asi que, como trabajan? Y, ¿cómo nos aseguramos de que los resultados sean significativos? Las siguientes secciones describen las formas clásicas de las pruebas.

Vale la pena señalar que el número de empresas y organizaciones que desarrollan estas pruebas está aumentando rápidamente, y están desarrollando muchas variaciones sobre los temas básicos. Estas variaciones buscan mejorar los parámetros de prueba que afectan el costo, la calidad y el tiempo de la prueba. Sin embargo, las formas fundamentales en que funcionan las pruebas y los márgenes de error no han cambiado desde que se desarrollaron por primera vez entre hace ~30 y 50 años atrás.

¿Por qué son imposibles las pruebas perfectas?

El objetivo de cualquier prueba es el 100% de perfección, de modo que cada persona que tiene una infección da positivo, y cada persona que no tiene una infección, de 100 negativo. La perfección no se puede lograr en la palabra real, y los temidos términos sensibilidad y especificidad se utilizan para definir la imperfección de una prueba.

La sensibilidad describe el número más pequeño de moléculas (el umbral de prueba) que necesita para decir que el resultado de una prueba es positivo. Cuando se necesitan relativamente más moléculas para la detección, se producen resultados falsos negativos. Estos serían individuos que tienen una infección, pero su número de moléculas da como resultado una señal que está por debajo del umbral de detección. Por lo tanto, su infección no se puede detectar.

La especificidad es la inversa y define qué tan bien la prueba puede discriminar entre diferentes moléculas o señal del ruido. Usando el umbral de detección anterior como ejemplo, si el ensayo tiene demasiados resultados falsos negativos, podemos “bajar la barra” para que el ensayo detecte un número menor de moléculas. El ensayo se hace más sensible porque detecta señales más bajas.

Ahora, algunos de los falsos negativos identificados previamente se convierten en verdaderos positivos, pero algunos de los verdaderos negativos se convierten en falsos positivos. De esta manera, la sensibilidad y la especificidad están interrelacionadas.

Los valores de sensibilidad y especificidad generalmente se expresan como proporciones, convertidas a porcentaje, de resultados verdaderos (positivos o negativos) a los resultados totales. Por lo tanto, una prueba que tiene una sensibilidad del 95% significa que el 5% de las pruebas negativas están o han sido infectadas.

Del mismo modo, una especificidad del 95% significa que el 5% de los que dan positivo no están infectados o no lo están. ¿Qué medida es más importante, sensibilidad o especificidad? Eso depende del objetivo del ensayo de diagnóstico.

Prueba Molecular

Las pruebas moleculares comunes usan PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para detectar moléculas de ADN. En la PCR, los cebadores de ADN sintéticos que complementan las secuencias de ADN que flanquean una región de interés, se combinan con una enzima de ADN polimerasa termoestable, los cuatro bloques de construcción de ADN (2-desoxiadenosina trifosfato, 2-desoxicitosina trifosfato, 2-desoxiguanosina trifosfato y 2-desoxitimidina trifosfato; juntos conforman los famosos dNTP) y un detector.

Se utilizan ciclos repetidos de altas y bajas temperaturas para unir cebadores, sintetizar ADN y fundir las piezas. Si la región de ADN de interés está presente, cada ciclo duplica la cantidad de ese ADN. La cantidad de ADN producido se puede medir usando un detector (también conocido como cuantitativo, qPCR). El más simple es un tinte que une el ADN bicatenario (dsDNA) y se vuelve fluorescente.

La intensidad de fluorescencia aumenta con cantidades crecientes de dsDNA. Pero los coronavirus contienen ARN, y la PCR amplifica el ADN. Para superar este problema, el ARN se convierte primero en ADN utilizando una enzima (RT, transcriptasa inversa) que hace copias de ADN a partir de ARN. Por lo tanto, para detectar vRNA, se utiliza RT-PCR.

Una ventaja de la prueba molecular es que no es invasiva. Las partículas virales utilizadas en las pruebas se obtienen a través de hisopos que se han limpiado en alguna superficie del paciente. Si bien tener un hisopo en la nariz o en la garganta puede parecer invasivo, médicamente hablando no lo es.

Debido a que las pruebas moleculares detectan el ARN viral, también se pueden usar para probar superficies donde podrían estar los virus, o decirnos dónde pudieron haber estado los virus.

Consideraciones de pruebas moleculares

Los factores que afectan la sensibilidad de las pruebas moleculares incluyen contaminación, hibridación de secuencia no específica, artefactos de PCR y un umbral de detección demasiado alto. Los ensayos basados ​​en PCR pueden ser extremadamente sensibles y la contaminación puede ser un gran problema. En el caso de COVID-19, la consecuencia de un falso positivo es la cuarentena. No está tan mal cuando uno considera que cada infección activa puede producir más infecciones. Los falsos negativos, por otro lado, significan que las personas infectadas no saben que están infectadas y pueden infectar a más personas.

En el caso de la hibridación de secuencia no específica donde los cebadores de PCR coinciden con los objetivos deseados y no deseados, los falsos positivos se reducen mediante el diseño del ensayo y buenos controles que incluyen ADN de otros tipos de infecciones comunes. De manera similar, los artefactos de PCR, donde los cebadores se unen a otros cebadores y dan como resultado una amplificación de ADN no deseada, se pueden controlar con pruebas que no contienen ningún ADN agregado (conocido como espacios en blanco que solo contienen el tampón de ensayo). Las muestras en blanco también controlan la contaminación.

Como la especificidad es el yin al yang de la sensibilidad, los falsos negativos se ven afectados por el umbral de sensibilidad del ensayo, la degradación del ARN, la variación de la secuencia del ADN y cuando se realizan las pruebas. La degradación del ARN es lo opuesto a la contaminación. Es decir, el material comprobable no está presente. Se evita la degradación con el manejo adecuado de la muestra y el tratamiento de muestras de control positivo de la misma manera que las muestras de prueba.

La variación de la secuencia de ADN, donde las mutaciones cambian la secuencia de un sitio de unión del cebador esperado, puede reducir o “bloquear” la amplificación. Este tipo de error se controla mediante el diseño de ensayos que se dirigen a múltiples ubicaciones, por lo que si una región falla, otras regiones aún pueden amplificarse. El último problema, cuando se realizan las pruebas, es importante. Si las personas infectadas se prueban demasiado pronto, antes de la replicación viral, sus infecciones pueden pasarse por alto.

Como todavía no hemos llegado a un punto de pruebas masivas, donde las personas sanas e infectadas son evaluadas y monitoreadas, este tipo de error sigue siendo desconocido. Finalmente, los controles positivos que dan los resultados esperados nos dicen que una prueba está funcionando correctamente.

Pruebas serológicas

Las pruebas serológicas detectan anticuerpos que se unen a proteínas virales. Los anticuerpos se encuentran en la sangre, por lo que las pruebas serológicas, a diferencia de las pruebas moleculares, son técnicamente invasivas porque se debe usar una aguja para perforar la piel y extraer sangre. También conocidos como inmunoensayos, las pruebas serológicas, como las pruebas moleculares, siguen un formato común. En este ejemplo, el formato es un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). También hay muchas variaciones sobre este tema.

En el enfoque general, una superficie sólida está recubierta con material antigénico. El material puede ser viriones intactos (no infecciosos), proteínas virales purificadas o incluso péptidos sintéticos. La superficie sólida se incuba primero con sangre (suero) de los individuos. Si los anticuerpos antivirales están presentes, se unen a los antígenos. Después de un período de tiempo, la superficie se lava para eliminar el material no unido.

Luego, se agrega otro anticuerpo, producido en un organismo diferente (con cabras y conejos como favoritos), que se une a los anticuerpos humanos. Este anticuerpo tiene un reportero enzimático adjunto, por lo tanto, “Enzima vinculada”. Después de otro período de incubación, el exceso de material se lava y se agrega un químico (sustrato de la enzima unida). La enzima unida convierte el sustrato en un producto coloreado y la intensidad del color,

Consideraciones de pruebas serológicas

En comparación con las pruebas moleculares, las pruebas serológicas son bastante simples. Agregue la muestra, lave, agregue la enzima anti-anticuerpo, lave y detecte. ¿Qué puede salir mal? Mucho. En términos de sensibilidad, los falsos negativos provienen del culpable habitual de los umbrales de detección que se establecen demasiado altos. Como anteriormente, los umbrales de detección se definen cuando se desarrolla el ensayo. Los umbrales intercambian la capacidad de detectar a todas las personas que han sido infectadas con la posibilidad de que algunas personas que resulten positivas no se hayan infectado.

En el caso de las “tarjetas de inmunidad”, probablemente no sea una buena idea entregar tarjetas a aquellos que nunca han sido infectados, por lo que queremos una alta especificidad con nuestra tasa de falsos positivos lo más baja posible. Incluso entonces, la presencia de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 no es garantía de inmunidad, y limita aún más la utilidad de las tarjetas de inmunidad.

La contaminación se controla mediante un fuerte control de calidad de fabricación (GMP: buenas prácticas de fabricación) y una operación de prueba (con operadores bioquímicos bien calificados y procedimientos operativos estándar (SOP). Los POE también minimizan la probabilidad de resultados falsos positivos y falsos negativos que surgen del lavado insuficiente o excesivo, o de los tiempos de incubación excesiva o excesiva.

Los anticuerpos, como los cebadores de ADN, a menudo se unen a cosas a las que no queremos que se unan. Esto es aún más probable si no se tiene cuidado. Por ejemplo, otros coronavirus pueden tener picos de proteínas similares. Como algunos de estos causan resfriados comunes, podrían causar falsos positivos en los ensayos si no se utilizan los controles adecuados.

Un desafío mayor es realizar las pruebas en el momento adecuado del ciclo de infección. Como se observa en el perfil de biomolécula, los anticuerpos se desarrollan después de que una persona ha sido infectada. Este desarrollo es muy variable con respecto al inicio y la fuerza de la respuesta inmune en cada individuo.

Hasta el momento, tenemos pocos datos sobre las respuestas inmunitarias de COVID-19 en grandes poblaciones, por lo que los falsos negativos debido al tiempo de análisis, la duración de la persistencia de los anticuerpos y los umbrales de análisis aun no se saben.

En resumen, las pruebas de anticuerpos pueden tener más variabilidad que las pruebas moleculares.

Tarea para casa

Se están utilizando pruebas moleculares y serológicas para identificar infecciones por SARS-CoV-2/COVID-19. Las pruebas moleculares (RT-PCR) solo miden las infecciones activas y las pruebas serológicas (inmunoensayo) son mejores para la etapa tardía y el monitoreo posterior a la infección. Ninguna prueba es perfecta y ambos métodos tienen varios tipos de problemas que dan resultados falsos positivos y falsos negativos.

Los resultados falsos negativos disminuyen la sensibilidad de una prueba y los resultados falsos positivos disminuyen la especificidad de una prueba. Los controles de ensayo y los resultados esperados proporcionan una verificación adicional para garantizar que se puedan alcanzar las sensibilidades y especificidades más altas.

Y, una cosa más, los anticuerpos no equivalen a inmunidad. Ese es un tema para otro momento.
Por Edwin W. & Mary Gabriela

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Referencias

– Para obtener más información sobre las empresas que trabajan en COVID-19, visite: https://biotech-careers.org/company-core-activity/covid-19

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