Principio
El método de transferencia Western fue propuesto por primera vez por Towbin en 1979, La idea principal de la transferencia Western es detectar y analizar proteínas.
Western blot es una técnica en Biología molecular de uso común diseñada para estudiar una proteína específica en una muestra que contiene muchas otras proteínas.
– En el Western Blot, una proteína individual de interés se identifica utilizando un anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o ligado a enzimas específico para esa proteína.
– Una mezcla de proteínas se separa electroforéticamente en un gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) , un gel en placa infundido con un agente de disociación llamado dodecilsulfato de sodio (SDS).
– Las bandas de proteína se transfieren a una membrana de nitrocelulosa mediante un proceso electroforético llamado transferencia, donde luego se inmovilizan las proteínas.
– La proteína deseada en la membrana puede detectarse mediante el uso de un anticuerpo primario marcado dirigido contra la proteína o un anticuerpo secundario marcado dirigido contra el anticuerpo primario en el complejo antígeno-anticuerpo.
– Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden visualizar de diversas formas;
- Si la proteína de interés se une a un anticuerpo radiactivo, su posición en la transferencia se determina mediante autorradiografía de rayos X.
- Si se emplean anticuerpos ligados a enzimas, la adición de sustrato cromogénico produce un producto altamente coloreado e insoluble en el sitio de la proteína diana y lo hace visible.
- Una forma más sensible es el uso de un compuesto quimioluminiscente con agentes potenciadores adecuados para producir luz en el sitio de la proteína y hacerlo visible.
Procedimiento/Pasos:
Paso I: Extracción de Proteína
– El lisado celular es la muestra más común para la transferencia Western.
– La proteína se extrae de la célula mediante lisis mecánica o química de la célula. Este paso también se conoce como preparación del tejido.
– Para evitar la desnaturalización de la proteína se utiliza un inhibidor de la proteasa.
– La concentración de proteína se determina por espectroscopia.
– Cuando se obtiene una cantidad suficiente de muestra de proteína, se diluye en un tampón de carga que contiene glicerol, lo que ayuda a hundir bien la muestra.
– También se agrega colorante de seguimiento (azul de bromotimol) en la muestra para controlar el movimiento de las proteínas.
Paso II: electroforesis en gel
– La muestra se carga en un pocillo de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico SDS-PAGE.
– Las proteínas se separan en función de la carga eléctrica, el punto isoeléctrico, el peso molecular o una combinación de todos ellos.
– La proteína de tamaño pequeño se mueve más rápido que la proteína de tamaño grande.
– Las proteínas tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el polo positivo (ánodo) cuando se aplica corriente eléctrica.
Paso III: Secado
– La membrana de nitrocelulosa se coloca sobre el gel. La proteína separada del gel se transfiere al papel de nitrocelulosa por acción capilar. Este tipo de transferencia requiere mucho tiempo y puede demorar de 1 a 2 días.
– Para una transferencia más rápida y eficaz de la proteína deseada del gel al papel de nitrocelulosa, se puede utilizar electrotransferencia.
– En la electrotransferencia, la membrana de nitrocelulosa se intercala entre el gel y el casete de papel de filtro y luego se pasa corriente eléctrica a través del gel, lo que provoca la transferencia de proteína a la membrana.
Paso IV: Bloqueo
– El bloqueo es un paso muy impotante en el Western Blot.
– Los anticuerpos también son proteínas, por lo que es probable que se unan al papel de nitrocelulosa. Entonces, antes de agregar el anticuerpo primario, la membrana se satura o se enmascara de manera no específica usando caseína o albúmina de suero bovino (BSA).
Paso V: Tratamiento con Anticuerpo Primario
– El anticuerpo primario (1° Ab) es específico de la proteína deseada, por lo que forma el complejo Ag-Ab
Paso VI: Tratamiento con anticuerpo secundario
– El anticuerpo secundario está marcado con una enzima. Por ej. La fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante (HRP) se marca con un anticuerpo secundario.
– El anticuerpo secundario (2° Ab) es un anticuerpo contra el anticuerpo primario (anti-anticuerpo) para que pueda unirse con el complejo Ag-Ab.
Paso VII: Tratamiento con sustrato adecuado
– Para visualizar la acción de la enzima, la mezcla de reacción se incuba con sustrato específico.
– La enzima convierte el sustrato para dar un producto de color visible, por lo que se puede visualizar una banda de color en la membrana.
– La transferencia Western también es una prueba cuantitativa para determinar la cantidad de proteína en la muestra.
Factores que intervienen
El resultado de una técnica de western blot depende de tres factores importantes:
a- La capacidad del anticuerpo para unirse a una proteína específica.
b- La fuerza de la interacción.
c- La concentración de la propia proteína de interés.
Además, la especificidad de la unión al objetivo y la baja reactividad cruzada también son características importantes.
Los resultados del western blot no siempre son fáciles de interpretar ya que el tamaño de la proteína puede variar del peso teórico debido a modificaciones postraduccionales, como glicosilación o interacciones con otras proteínas.
Sin embargo, el western blot es un método muy común y casi todos los anticuerpos comerciales disponibles han sido validados con este método.
Cómo analizar datos de Western Blot
Para estimar el peso molecular de la proteína se puede hacer una comparación con proteínas marcadoras y se puede determinar la cantidad de proteína ya que está relacionada con la intensidad de la banda (dentro de los límites del sistema de detección). Tendremos una publicacion dedicada a este punto de manera detallada con un software para analizar bandas de Western blott
Mire nuestro video tutorial y obtenga una comprensión completa de cómo es esta tecnica sus usos y una heramienta informatica para analizar las bandas de los pesos moleculares.
¿Cuáles son las ventajas del Western Blot?
Sensibilidad: debido a su capacidad para detectar tan solo 0,1 nanogramos de proteína en una muestra, la técnica teóricamente puede servir como una herramienta de diagnóstico temprano eficaz, detectando incluso la más mínima respuesta inmunogénica de un virus o bacteria en una muestra de paciente.
Especificidad: La técnica de western blot debe su especificidad a dos grandes factores contribuyentes. Primero, la electroforesis en gel clasifica una muestra en proteínas de diferente tamaño, carga y conformación. Este proceso en sí mismo es un gran paso hacia la detección, ya que las bandas formadas en el gel ya dan pistas sobre el tamaño de la proteína o polipéptido de interés.
La especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno es el segundo gran factor. Debido a que los anticuerpos específicos muestran afinidad por proteínas específicas, el proceso puede detectar selectivamente una proteína objetivo incluso en una mezcla de 300 000 proteínas diferentes.
Aplicaciones de Western Blot
Aplicaciones de Western Blot en Ciencias Biológicas
Se utiliza un western blot para detectar moléculas de proteínas específicas de entre una mezcla de proteínas. Esta mezcla puede incluir todas las proteínas asociadas con un tejido o tipo de célula en particular.
Las transferencias Western también se pueden usar para evaluar el tamaño de una proteína de interés y para medir la cantidad de expresión de proteína. Este procedimiento recibió su nombre por su similitud con el método inventado anteriormente conocido como transferencia de Southern que en una futura publicación la veremos detalladamente.
Además, es útil para comparar las expresiones de una proteína diana de varios tejidos, o para ver cómo responde una proteína en particular a una enfermedad o tratamiento farmacológico.
En muchos casos, el western blot se usa en combinación con otras técnicas clave de detección basadas en anticuerpos, como la inmunohistoquímica.
Aplicaciones de Western Blot en Medicina
En el campo médico reciente, Western Blot tiene una amplia gama de aplicaciones en el diagnóstico médico, como la aplicación de diagnóstico médico para la infección por VIH (virus de inmunodeficiencia humana), BSE (encefalopatía espongiforme bovina, también conocida como “enfermedad de las vacas locas”), FIV (Virus de Inmunodeficiencia Felina), infección por VHB (Virus de la Hepatitis B), etc. Por lo general, el Western Blot se utiliza como prueba de confirmación para estas enfermedades, luego de una prueba ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) de alta sensibilidad con resultados positivos.
Por ejemplo, con el VIH y la enfermedad por priones, los western blot se utilizan como una pantalla complementaria clave, ya que sus resultados son menos ambiguos y más rápidos que otros métodos.
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Referencias
– https://blog.praxilabs.com/2020/05/29/western-blot-concept/
– https://www.mblintl.com/resources/scientific-resources/fundamentals-for-planning-research/the-principle-and-method-of-western-blotting-wb/