🟢 Fundamento de la electroforesis de ADN y proteínas, Usos y tipos 🧪🔬🤓

1. Definición

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas en un campo eléctrico, para hacerlas migrar hacia los electrones de carga opuesta.de separación mediante la cual se somete la sustancia a un campo eléctrico.

La electroforesis se aplica para la separación de ADN, ARN y proteínas. Las moléculas de ADN tienen carga (-), por lo tanto, según su tamaño, la molécula de ADN migra al ánodo con carga (+), es decir, las moléculas pequeñas se mueven más rápido a través de los poros de la matriz que las moléculas más grandes.

La migración se debe a la carga de las moléculas y al potencial aplicado a través del electrodo, estas moléculas migran a diferentes velocidades y en diferentes longitudes según su carga, masa y forma (factores que determinan qué tan lejos migrarán las moléculas).

– Esto se hace pasándolos a través de un gel (como gelatina) en un campo eléctrico.
– El gel actúa como soporte para la separación de las moléculas de diferentes tamaños.
– El gel generalmente se compone de un material gelatinoso llamado agarosa que está hecho de algas marinas.

2. Medios de soporte para realizar la electroforesis

La muestra debe situarse sobre un medio soporte. En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (“geles”, medio semisólido o gelatinoso) están formados por polímeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la separación.

Agarosa: Es un polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.

Poliacrilamida: El gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

Agarosa + poliacrilamida: Se consigue una porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: El dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinónimo: laurilsulfato sódico) es un detergente aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.

3. Modos de disposición del soporte

Horizontal

Se lleva a cabo con gel de agarosa para ácidos nucleicos. Para el corrimiento el buffer debe cubrir el gel, con la finalidad de evitar que se seque por el calentamiento inducido por el paso de la corriente eléctrica. Al momento de cargar las muestras en los pocillos, se puede optar por hacerlo en seco; esto es, llenar parcialmente la cámara con líquido de corrimiento de tal manera que la parte superior del gel no se cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse sin la interferencia del líquido. Una vez cargada la muestra, se corre por unos minutos a bajo voltaje hasta que la muestra entre en el gel y entonces se cubre del todo con el buffer de corrimiento. También existe la técnica denominada electroforesis submarina, en la que la totalidad del gel se cubre con buffer de corrimiento, desde el momento de cargar las muestras en los pocillos como se ejemplifica en la imagen. En esta técnica el buffer siempre debe cubrir el gel, y se llama submarina cuando la muestra se coloca con el gel sumergido en el buffer.

Vertical

Empleada exclusivamente con gel de poliacrilamida, se utiliza para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tamaño. El gel debe estar contenido entre dos placas rectangulares de vidrio donde la corriente eléctrica se genera gracias al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las cubetas o compartimientos del ánodo y el cátodo como se aprecia en la imagen.

4. Procedimiento general de una electroforesis para ácidos nucleicos (ADN)

A continuación, se exponen los pasos de los que consta una electroforesis típica.

El método más común para la electroforesis de ADN es elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentración de 0.5 a 2%. La carga eléctrica de la molécula de ADN la otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa. Dado que la forma de la molécula de ADN siempre es la misma, la movilidad de la electroforesis dependerá únicamente de la longitud del ADN (pb) y se representará en bandas.

El corrimiento se realiza a voltajes de entre 25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimiento. El avance electroforético se monitorea a través de la visualización de los colorantes (azul de bromofenol y azul de xileno) contenidos en el buffer de carga con el que se mezcló con la muestra previa a su colocación en el pocillo. Si los fragmentos de ADN son pequeños (menos de 50 pb) o bien se requiere discernir entre fragmentos de ácidos nucleicos con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda utilizar un gel de poliacrilamida que permita esta resolución.

El volumen de agarosa depende del tamaño de la cámara de electroforesis; 20 a 25 ml son suficientes para las dimensiones más comunes del gel: 8 × 6 × 0.5 cm (L × A × A). Inmediatamente después de vaciar la agarosa a la cámara, debe insertarse el o los peines necesarios. La agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 minutos, mientras que la poliacrilamida, unos 30 minutos. Una vez solidificado el gel, se añade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a concentración 1x, cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm por encima del gel) y se retiran los peines.

Las muestras se mezclan con el buffer de carga y se depositan cuidadosamente en los pocillos, evitando que se salgan y puedan entrar en otros pozos contaminando el pocillo contiguo. Debe considerarse el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos, uno de los carriles, para la determinación del peso molecular de la muestra. Este marcador también debe mezclarse con un buffer de carga, excepto cuando ya viene preparado para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.

Una vez depositadas las muestras en los pocillos se procede a la transmisión de la corriente eléctrica. Se conectan los cables de la fuente de energía de cada polo eléctrico a la cámara de electroforesis en el electrodo que le corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso molecular de las moléculas de ADN que se va a separar. Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100 V. Para muestras de ADN genómico y plasmídico (> 2 kb) se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V.

Durante el corrimiento se monitorea la migración de la muestra con colores que contiene el buffer de carga, donde se observa el color azul y el verde correspondientes a los colorantes azul de bromofenol y azul de xileno, respectivamente. En geles de agarosa, dentro del rango de 0.5 y 1.5%, el azul de xileno migra de manera similar a un fragmento de ADN de 4 kb, mientras que el azul de bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb. La electroforesis se detiene cuando se considera que la muestra se localiza en la posición deseada, o bien cuando la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes del gel.

Hay múltiples factores que pueden afectar la migración del ADN, como la concentración del gel utilizado, el tamaño de la molécula de ADN muestra, el empaquetamiento del ADN, el voltaje, la temperatura del buffer de corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje es muy alto), la contaminación con agentes intercalantes en la muestra, la composición del buffer de corrimiento, etcétera.

¿Cuándo se usa la electroforesis en gel para separar fragmentos de ADN?

La electroforesis en gel se puede utilizar para una variedad de propósitos, por ejemplo:

– Para obtener una huella dactilar de ADN con fines forenses
– Para obtener una huella digital de ADN para pruebas de paternidad
– Obtener una huella digital de ADN para poder buscar relaciones evolutivas entre organismos.
– Para comprobar una reacción de PCR. Vea nuestro videoclip: Uso de electroforesis en gel para comprobar una reacción de PCR
– Para probar los genes asociados con una enfermedad en particular.

5. Procedimiento general de una electroforesis para proteínas

El método más empleado para electroforesis de proteínas se lleva a cabo en un sistema discontinuo; es decir, un gel conformado por dos geles de poliacrilamida (uno de resolución y otro de compactamiento), que difieren en su concentración, composición y pH. Los geles están unidos pero limitados por una fase de separación visible a contra luz; para lograrlo deben prepararse por separado esperando la polimerización total del primero, para continuar con la del segundo; de lo contrario, en estado líquido, se mezclarían.

Cabe recordar que en el caso de los geles de acrilamida para ácidos nucleicos sólo se tiene una fase, conformada por el gel de resolución, donde las moléculas de ADN migrarán, generando un patrón electroforético, según su tamaño.

Para electroforesis de proteínas, la acrilamida se prepara a partir de una solución al 30% de acrilamida-bisacrilamida 19:1. Ésta se mezcla con el buffer correspondiente y una solución de SDS; además, se añade persulfato de amonio (APS) y N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED) como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a 10 mM. El APS genera radicales libres, por lo que es un iniciador de la reacción de polimerización que finalmente forma el gel.

El TEMED funciona como otro iniciador de polimerización. Las propiedades del gel resultante dependen de la concentración de APS y TEMED, ya que un aumento en su concentración disminuye la longitud media de la cadena de polímero y, por lo tanto, disminuye su elasticidad y le resta transparencia al gel. Por ello, debe utilizarse la menor concentración posible de catalizadores que permita la polimerización en un tiempo óptimo.

El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el sistema completo se sumerge en el buffer de corrimiento dentro de la cámara vertical de electroforesis. En el momento de sumergir los geles en el tanque, se debe de asegurar que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer. Es común en los geles de acrilamida realizar un precorrimiento de unos 10 a 30 minutos a voltajes bajos, con el cual se asegura que los pocillos se limpien antes de cargar las muestras.

Para la preparación de la muestra de proteína, se realiza una reacción fisicoquímica, en la que se rompen enlaces peptídicos y puentes disulfuro por acción de detergentes iónicos (SDS), reactivos reductores (beta-mercaptoetanol) y temperaturas elevadas (95°C), que al final consigue desnaturalizar la proteína hasta su estructura primaria. La muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con cuidado en los pocillos, evitando la contaminación del pocillo contiguo.

Hay que considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de la muestra, que debe someterse a los mismos tratamientos que la proteína, excepto cuando se trate de un marcador previamente teñido, en que el que se obviará el uso del buffer de carga.

Una vez colocadas las muestras de proteínas en cada pocillo del gel, se conectan los cables correspondientes de los electrodos a la fuente de energía, con la selección de voltaje o amperaje adecuados. Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia multiplicada por 8-15 V permitirá determinar el voltaje del corrimiento.

El voltaje óptimo dependerá de la molécula que se piensa separar; en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) dependerá de la fuerza iónica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25 a 30 mA. La electroforesis se realiza hasta que el colorante, visualizado como una línea azul, haya llegado a los límites de la parte inferior del gel.

Separación de carga y pH

El enfoque isoeléctrico (IEF) y la electroforesis en gel de agarosa son dos formas en que las proteínas pueden separarse por sus diferentes cargas eléctricas. A diferencia de SDS-PAGE, las proteínas generalmente se mantienen en su estado nativo (plegado). El tipo de gel que se utiliza y la solución alrededor del gel también son diferentes.

En la electroforesis en gel de agarosa, las proteínas se cargan en el centro del pocillo. Las que tienen una fuerte carga negativa se mueven más rápido hacia el lado positivo del gel, mientras que las proteínas con carga positiva se mueven en la dirección opuesta.

Esta técnica podría usarse para separar proteínas que tienen el mismo peso molecular pero diferentes cargas, o cuando el tamaño no es importante (p. ej., para observar cambios en la presencia de diferentes proteínas durante el desarrollo de una enfermedad).

Electroforesis bidimensional

En estos días, la separación de carga (IEF) y tamaño (SDS-PAGE) a menudo se emplean juntas en electroforesis bidimensional, donde primero se usa la separación de carga y luego estas proteínas separadas se separan en función del tamaño.

Este es un método muy efectivo para identificar una proteína en particular de un tejido que puede contener miles de proteínas y donde solo puede haber pequeñas diferencias entre las muestras de control y las tratadas (por ejemplo, para buscar una proteína involucrada en la resistencia a la depredación de insectos en las plantas).

El siguiente video te explica el fundamento de la electroforesis en una y dos dimensiones. Velo completo y suscríbete a nuestro canal:

🟢 EXPLICACIÓN de la Electroforesis de proteínas en 1 y 2 Dimensiones 🧪🔬🤓

¿Cuándo se usa la electroforesis en gel para separar proteínas?

Gracias a programas de televisión como CSI, muchas personas están familiarizadas con el uso de la electroforesis en gel para separar macromoléculas como el ADN. Sin embargo, la electroforesis en gel también se puede utilizar para separar proteínas.

Diferentes proteínas tienen diferentes tamaños, principalmente debido a la cantidad de bloques de construcción de aminoácidos en su estructura. Las modificaciones químicas adheridas a la proteína también afectan su tamaño. Diferentes proteínas también tienen diferentes cargas. Esto puede deberse tanto a los tipos de aminoácidos utilizados para construirlos como a los tipos de modificaciones que se les atribuyen.

Se utilizan diferentes tipos de geles de electroforesis para proporcionar diferentes tipos de información. Por lo tanto, el tipo de gel que elija depende del tipo de pregunta que esté haciendo.

6. Revelado o detección

Tinción de proteínas y de ácidos nucleicos

Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las proteínas o los ácidos nucleicos.

En el caso para las proteinas suelen utilizarse colorantes orgánicos que interaccionan con las proteínas de forma poco selectiva, principalmente electrostática. Ejemplos: azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau.

Para los ácidos nucleicos se usa el azul de metileno o, más frecuentemente, compuestos fluorescentes e intercalantes, como el bromuro de etidio. Un compuesto intercalante es aquél que se introduce entre los pares de bases apilados del DNA.

Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolución del colorante y se espera a que aquél se impregne y así el colorante se una a las moléculas separadas en el gel. Tras lavar el gel para eliminar el exceso de tinción no unida específicamente, se observa, fotografía o cuantifica mediante densitometría.

7. Aplicaciones de la electroforesis

La electroforesis en gel de agarosa es un método utilizado habitualmente para separar proteínas, ADN o ARN.

– Estimación del tamaño de las moléculas de ADN.

Se aplica en uno de los pocillos de un gel SDS-PAGE una mezcla de proteínas de una sola subunidad, de tamaño conocido, denominadas “patrones” o “marcadores de masa molecular”. Tras su separación en la electroforesis, se revelan y se representa para todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o, mejor, cociente entre ésta y el avance del frente de electroforesis) frente al logaritmo del tamaño (masa molecular relativa, M_r). Sobre la línea de regresión se interpolan las distancias de avance de las muestras problema, calculando así su masa molecular aparente.

Como se ha indicado, se puede obtener una estimación de la masa molecular (en kDa) de proteínas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de moléculas patrón de tamaño conocido, con el fin de poder trazar la curva de calibrado. Para las proteínas, la validez del dato obtenido depende de que la desnaturalización con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las subunidades gracias a la reducción con mercaptoetanol. Todo esto te lo explico en el video en YouTube.

– Análisis de productos de PCR, por ejemplo, en diagnóstico genético molecular o huella genética
– Separación de ADN genómico restringido antes del análisis Southern, o de ARN antes del análisis Northern.
– La electroforesis en gel de agarosa se emplea ampliamente para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN después de la digestión con enzimas de restricción, por ejemplo, en el mapeo de restricción de ADN clonado.
– La electroforesis en gel de agarosa se usa comúnmente para resolver ADN circular con diferente topología de superenrollamiento y para resolver fragmentos que difieren debido a la síntesis de ADN.
– Además de proporcionar un medio excelente para los análisis de tamaño de fragmentos, los geles de agarosa permiten la purificación de fragmentos de ADN. Dado que la purificación de fragmentos de ADN separados por tamaños en un gel de agarosa es necesaria para varias técnicas moleculares, como la clonación, es vital poder purificar fragmentos de interés del gel.

– Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a las técnicas de hibridación, como el Southern blot (ADN) o el Northern blot (ARN), donde la presencia de determinada secuencia del ácido nucleico en una mezcla de moléculas se distingue por su tamaño, la cual se confirma por hibridación con una sonda específica.

– En el caso de las proteínas, la electroforesis se aplica para la identificación de fracciones proteicas o proteínas particulares por tamaño, como es el caso de la electroforesis de globulinas, o proteínas séricas; pero, sobre todo, para la identificación de moléculas particulares empleando posteriormente una reacción antígeno-anticuerpo específica en la técnica de Western blot.

– Asimismo, la electroforesis es crucial en técnicas como la secuenciación, donde tras un corrimiento electroforético de las cuatro reacciones de elongación con los dideoxinucleótidos, se puede deducir la secuencia del segmento de ácido nucleico. Inclusive, los secuenciadores automáticos modernos emplean una electroforesis capilar para el discernimiento de la secuencia.

8. Ventajas de la electroforesis en gel de agarosa

Para la mayoría de las aplicaciones, solo se necesita una agarosa de un solo componente y no se requieren catalizadores de polimerización. Por tanto, los geles de agarosa son sencillos y rápidos de preparar.
– El gel se vierte fácilmente, no desnaturaliza las muestras.
– Las muestras también se pueden recuperar.

9. Desventajas de la electroforesis en gel de agarosa

– Los geles pueden derretirse durante la electroforesis.
– El búfer puede agotarse.
– Las diferentes formas de material genético pueden presentarse en formas impredecibles.

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