🟢 Cómo analizar datos de Western Blot con ImageJ🧪🔬🤓

Western blot es un mecanismo indispensable en el laboratorio de investigación biomédica moderno, así como en los laboratorios que realizan investigaciones en otras áreas. Se considera como una técnica analítica utilizada principalmente en biología molecular e inmunogenetica donde se utilizan anticuerpos para detectar específicamente su antígeno.

Este protocolo le permitirá cuantificar relativamente (sin valores absolutos) las bandas de los geles de proteínas de Western blot (s. La cuantificación reflejará las cantidades relativas como una proporción de cada banda de proteína en relación con el carril control de los pesos moleculares.

La misma técnica se puede utilizar para la cuantificación de bandas de ADN o ARN.

ImageJ es un software gratuito basado en Java (se ejecuta en todos los sistemas operativos) de Wayne Rasband del Instituto Nacional of Health (EE. UU.) y está disponible para su descarga en: http://rsb.info.nih.gov/ij/

Antes de analizar cómo analizar los datos de Western Blot, puede obtener más información sobre el concepto y los procesos de Western Blot en nuestro artículo ” Western Blot: concepto, cómo usarlo y sus aplicaciones”. “

1. Escaneo de la imagen de la corrida de Western Blot

Lo mejor es utilizar un escáner de transparencias (escáner con fuente de luz a ambos lados de la cámara).
Con este tipo de escáner, cuando se selecciona el área de imagen mínima, el escáner minimiza la cantidad de fondo (depende del software). Un escáner regular con una buena resolución también puede hacer el trabajo.

Realice escaneos de alta resolución de sus imágenes a 600 dpi en formato de archivo TIFF. Guarde esto como su imagen sin procesar y guárdelo en un lugar seguro (no guarde nada sobre este original).

2. Preparar la imagen

Haga una copia de su imagen sin procesar original y con Photoshop o algún editor de imagen conviértala en un formato de archivo JPEG, luego cambie el modo de imagen a “Grayscale” que es escala de grises.

El método más simple para convertir a escala de grises es ir a Image>Type>8 bits. Su imagen debe parecerse a esto:

3. ImagenJ

Si actualmente no tiene ImageJ instalado, descárguelo aquí e instale el programa.

3.1 Configuración de los criterios de medición

En el menú “Analyze“, seleccione “Set Measurements” (Establecer medidas). De las casillas de verificación, SÓLO marque el “Grey mean value” que significa: Valor medio gris.

3.2 Preparar la Imagen

Vaya al menú “File” y abra el formato de archivo JPEG para cargar la imagen de la corrida. Maximiza la ventana y
use los atajos de teclado “+” / “–“ o “↑” / ”↓” para hacer zoom. Utilice un nivel de zoom adecuado. Para expandir la imagen en modo de zoom, seleccione la herramienta “hand” de la caja de herramientas de ImageJ. (Si maximizó la pantalla, la caja de herramientas puede estar oculta en el fondo).

3.3 Definición de una selección como región de interés (ROI)

Si hay múltiples proteínas de interés en su imagen de corridas, para cada fila de banda de proteínas a lo largo de los carriles, debe definir una sola región de interés.

Haga esto una fila de proteína a la vez. Seleccione la herramienta “rectangle” de ImageJ y dibuje un marco alrededor de la banda más grande de esa fila. Puede arrastrar y cambiar el tamaño del marco. Ajústelo para que cubra el área mínima para contener la totalidad de la banda más grande de la fila (A veces, una banda puede no ser plana, por lo que debe permitir más área para incluirla toda).

Una vez que tenga el marco del tamaño adecuado, haga clic en el menú “File“, “Save as“, “Selectión” y guarde este marco con el nombre de la proteína.

Si hay otras filas de bandas (otra proteína) presentes, defina y guarde un marco (ROI) para ellas también.
También debe hacer lo mismo con las bandas de control de carga.

3.4 Medidas

Para que cada proteína (fila) tome medidas, comenzará en el primer carril y utilizará el mismo marco para todas las bandas de proteínas en los otros carriles. Es muy importante que utilice el mismo marco en una fila. Si cambia el tamaño del marco por accidente o lo pierde, puede ir a abrir con “open” en el menú “File” y volver a importar el mismo marco.

Coloque el marco en la primera banda. El marco debe caber en todas las bandas ya que previamente lo dimensionaste de acuerdo a la más grande. Centre la banda dentro del marco y use el método abreviado de teclado “Ctrl“+“M” para registrar una medición (“Comando“+“M” en Mac o alternativamente haciendo clic en medir con “Measure” en el menú analizar con “Analyze“). Esto abrirá la ventana de medición y mostrará sus datos en orden. Mueva el marco al siguiente carril y realice la medición de esa proteína para todas sus muestras (a lo largo de la fila).

Cuando termine de analizar una fila, exporte los datos a una hoja de cálculo (por ejemplo, Microsoft Excel) y realice un seguimiento de qué valor pertenece a qué muestra. Cierre la ventana de medición de ImageJ para borrar las salidas.

Con el mismo marco que la proteína (fila), ahora tomará una medida de fondo. Para ello coloque el marco encima o debajo de cada banda de la fila, en un lugar donde no haya otras bandas o manchas en la película. Registre las medidas y expórtelas a la hoja de cálculo.

Abra el ROI de las otras filas o controles de carga y tome las medidas de la misma manera para las bandas y sus fondos y expórtelas a excel.

4. Fórmulas y cálculos de hojas de cálculo

Consulte la hoja de ejemplo de Excel en el Apéndice A para desambiguación.

Cuando tenga todos los datos de las bandas y sus fondos junto con las bandas de control de carga y sus fondos en su hoja de cálculo, debe escribir algunas fórmulas para hacer los cálculos.

– Invierta la densidad de píxeles para todos los datos (bandas/controles + sus fondos) en nuevas columnas. El valor invertido se expresa como 255 – X, donde X es el valor registrado por ImageJ. Por ejemplo, si la densidad de píxeles registrada por ImageJ es 234,5, el valor invertido debería devolver 20,5.

– Para las bandas de proteína y los controles de carga, exprese el valor neto restando el fondo invertido del valor de la banda invertida. Por ejemplo, después de hacer las inversiones, si una banda tiene un fondo de 3 y un valor de banda de 20,5, el valor neto debería devolver 17,5.

– Cuando las bandas netas y los controles de carga se calculan como paso final, tome una relación de un valor de banda neta sobre el control de carga neta de ese carril. Por ejemplo, si tuviera un valor de banda neta de 17,5 y un valor de control de carga neta de 4,5 para ese carril de banda de proteína, entonces la proporción es 17,5/4,5 = 3,88.

– Los valores finales de cuantificación relativa son la relación entre la banda neta y el control de carga neta.
Puede construir un gráfico de barras (u otro) para compararlos.

Apéndice A: Hoja de cálculo de muestra

En la siguiente hoja de cálculo, las columnas resaltadas en naranja tienen fórmulas detrás de ellas que calculan valores basados en los datos de ImageJ en columnas blancas.